1.1 受試藥物

應(yīng)激寧，批號：。由武漢華揚動物藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；羧甲基纖維素鈉，國藥試劑。

1.2 試驗動物

清潔級ICR小鼠，雌雄各半，體重18～22g，購于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2012-0004，使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0029。小鼠飼料由該中心提供，自由采食和飲水，試驗前在實驗動物房適應(yīng)3天，試驗給藥前停食12 h，不限制飲水。

6周齡清潔級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體重公鼠在130~150g之間，母鼠在120~140g之間，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2012-0004，使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0029。

1.3 試藥準(zhǔn)備

精確稱取試藥12.5g，加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液50ml，配制成0.25g/ml的混懸液備用。

1.4 急性毒性試驗

1.4.1 方法

取8只小鼠（雌、雄各半）分為兩組，每組4只，每組設(shè)2個重復(fù)，禁食12h 后，取上述混懸藥液，灌胃給藥1次，灌胃給藥體積2ml/100g（相當(dāng)于原生藥5000mg/Kg）。給藥后4 h內(nèi)連續(xù)觀察，之后每天上午和下午分別由試驗人員肉眼各觀察1次，連續(xù)觀察7 d。

1.4.2 評價指標(biāo)

小鼠存活率，精神狀況、采食量、飲水量、排便。

1.5 耐受性試驗

按照獸藥評審中心《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》之獸藥急性毒性試驗指導(dǎo)原則精神，將動物數(shù)增至10只，并重復(fù)2次試驗。即又取20只小鼠（雌雄各半），再次進行灌胃給藥1次，灌胃給藥體積2ml/100g，給藥后4h內(nèi)連續(xù)觀察，之后每天上下午各觀察1次，連續(xù)觀察7d，結(jié)果小鼠全部存活，即受試藥物應(yīng)激寧的LD50大于5000mg/Kg，提示該受試物毒性很低，依據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家食品編．中藥、天然藥物急性毒性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則GPT2-1[S]．2005．）改用耐受量給藥試驗。

1.5.1 方法

ICR小鼠40只，隨機分成2組，即陰性對照組和染毒組（試驗組），每組20只，雌雄各半，試驗前禁食不禁水12h。染毒組小鼠按2ml/100g BW灌胃試藥混懸液，間隔3h后重復(fù)灌胃給予等體積試藥；陰性對照組灌胃給予等容積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，給藥后4h 內(nèi)連續(xù)觀察，之后每天上午和下午分別由試驗人員肉眼各觀察1次，連續(xù)觀察7d。

1.5.2 評價指標(biāo)

觀察動物精神狀態(tài)、毛色、自主活動、呼吸、飲食、二便、口鼻分泌物等一般狀態(tài)，并詳細記錄動物的中毒表現(xiàn)和特點，毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的時間、死亡時間，觀察期結(jié)束后將所有存活小鼠脫臼處死，進行眼觀病理學(xué)檢查。

1.6 亞慢性毒性試驗

1.6.1 給藥劑量及分組

將80只Wistar大鼠隨機分為4組，分別為應(yīng)激寧高、中、低劑量組和空白對照組，每組20只，雌雄各半。組內(nèi)動物個體體重相差應(yīng)不超過平均體重的20%，組間平均體重相差不超過5%。

由于急毒試驗沒有測出LD50，90天喂養(yǎng)試驗的高劑量組按耐受劑量10g/kg，混飼給藥，分為低，中，高劑量組及對照組。給藥各組劑量分別定為：0.0g/kgBW，2.5g/kgBW，5.0g/kgBW，10g/kgBW，連續(xù)給藥90天。

1.6.2 檢測項目與方法

服藥期間每天肉眼觀察大鼠的一般行為（包括精神狀態(tài)，行為活動，采食量，飲水量，毛色，對外反應(yīng)，糞便等）、中毒及死亡情況；同時記錄飲水量、采食量，并按周測量大鼠體重，投入飼料量和剩余飼料量。并計算平均攝食量、增重。將染毒劑量組與對照組加以比較和統(tǒng)計學(xué)處理，及時記錄和分析大鼠的中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時間。